化学发光基础知识 二维码
发表时间:2016-06-04 00:00 一、什么是化学发光,与放免、酶免比较有何不同? 化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)是将化学发光与免疫反应相 结合,用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。 化学发光免疫分析比放射免疫,酶联免疫具有更高灵敏度,具备操作简便、快速的特点, 易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂,试剂保存期长,应用于生物学、医学研究和临床 实验诊断工作,成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。 (1) 与放免(RIA)产品比较 与放射免疫试剂(RIA)比较,化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害, 大大缩短了反应时间,同时兼具高灵敏度的优势。 (2) 与酶免(ELISA)产品比较 灵敏度与可测范围远远高于酶免产品,兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。 二、什么是标记免疫技术,它的三大要素是什么? 将Ag或Ab用标记物(如荧光素、酶、放射性同位素、化学发光物质等)进行标记,在与标本 中的相应Ab或Ag反应后,可以不必测定Ag-Ab复合物本身,而测定复合物中的标记物,通过标 记物的放大作用,进一步提高了免疫技术的敏感性。 三要素:通常在检测系统中会使用到一种叫标记物(labeling)的物质,常标记在抗体上 通常会有一个分离(separation)的过程在最后读取信号前 需要去仔细关注一下分析的模式(format) 三、标记免疫技术主要有哪几种? 主要经历了四种标记免疫技术的发展: 荧光素(Fluorophores) - FIA 放射性同位素(Radioisotopes) - RIA 酶(Enzymes) - EIA 化学发光物质-CLIA 四、化学发光原理? 分析方法及过程 釆用微孔板作为固相载体,以鲁米诺作为发光剂,固相载体的应用扩大了测定的范围。以竞争法、夹心法等免疫测定方法为基础。每个试剂盒都包含标准品、酶结合物、底物、洗液、包被板,降低了试剂成本,减少了交叉污染,保证了检测质量。 ⑴、抗原抗体结合:将待测标本加入包被单克隆抗体的微孔板中,标本中的抗原与微孔板的抗体结合,再加入辣根过氧化物酶标记的抗体,经温育后形成固相包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物。 ⑵、洗涤、分离:经过5次洗涤,很快将未结合的多余抗原和酶标记抗体洗去。 ⑶、加入底物luminol发光剂:luminol被结合在微孔板的辣根过氧化物酶的催化下可以催化经过过氧化氢的分解,使过氧化氢变成水和单氧,其中单氧可氧化鲁米诺,鲁米诺经氧化后可发出蓝光。这种化学发光持续时间长,可达数小时之久。通过光量子阅读系统记录发光强度,并从标准曲线上计算出待测抗原的浓度。 五、什么是钩状效应(hook effect),如何判断及解决? 免疫测定的实质是抗原抗体反应,抗原抗体反应是按•定的分子比例结合,当二者比例适中 时,形成的免疫反应最强烈,形成复合物或检测的信号与所测的抗原或抗体成比例关系,但当抗 原或抗体其中一者过量时,免疫反应将减弱,测定值呈现假性低值。 在化学发光中像二步分析法…般都能避免钩状效应,对于一步夹心法项目说明书中都提到了 产生钩状效应的上限如人绒毛膜促性腺激素的钩状效应值是100万在实际工作中如遇到 测定值与临床严重不符的结果要考虑到钩状效应,解决办法是稀释此样本。 六、什么是嗜异性抗体? 病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体(通常是鼠或羊),-般来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗,分析的干扰:可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性,可以在单克隆/多克隆分析模式中出现假阴性。 厂家在试剂生产中会加入封闭剂,封闭剂可以加在反应基质中或整合在试剂盒内:鼠(鼠科 类),鸟(鸟科类)和羊蛋白,各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响!当遇到与临床不符的结果时要询问病史看是否有嗜异性抗体的干扰。 七、什么是基质效应? 基质是指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰,并影响分析结果的准确性。目前最常用的去除基质效应的方法是,通过已知分 析物浓度的标准样品,同时尽可能保持样品中基质不变,建立一个校正曲线(calibration curve)。 八、稀释样品时稀释物不对为何有基质效应? 我们在稀释样品时要考虑到基质效应的影响,稀释必须在适当的基质中进行,对于 大多数测定而言,适当的基质就是零校准品,如果分析物稀释基质效应中所含成分浓度不正 确,稀释回收率就不能对它们进行准确的测定,因为它们稀释后会与Bing agent形成新的平衡。 九、如何看待说明书中的方法局限性? 此章节的内容极为重要,实验室工作人员必须对其进行理解,因为它关系到实验室能否对 样本分析结果进行正确的解释。在解释结果时,需参照该病人的整体临床情况,包括:症状、 临床病史以及其它测试所得的数据和其它相应的信息。 十、如何理解最高可报告值? 当样品浓度高时,可以报告大于最高校准品值的结果,有些试剂生产商的的测定系统通常 用亮点调整来代替完全校准,这样的话他们可报告范围是一个拟合而出的最高水平(而非 实际测定值)。而在ACCESS检测系统中,用户自己创建了标准曲线,当该标准曲线意境通 过并且质控检测被接受时,就可以证实其可报告的上限。当样本分析所得的RLU值高于最 高校准品时,以样本结果大于最高校准品值的形式报告,多数实验室对大多数测定项目的 分析结果使用这种直接报告模式,如果需要获得确切的测定值,则需要进行机外人工稀释 并重新分析样本。 十一、如何理解最低可报告值? 所有的定景测定在曲线的下端通常都有一个零标准,该标准允许计算结果低至零,当测定 结果越接近零时,测定结果就越不那么精确。在说明书中给出了项目的检测最低下限,建 议以低于该下限来报告结果。 十二、什么是分析灵敏度? 分析零敏度通常是对标准曲线上的零点校准品距零值的2SD值范围来进行测定计算的(而 SD值是将零校准品作为未知浓度样品经多管检测后计算均值所得) 十三、什么是功能灵敏度? 功能灵敏度(Functional sensitivity)为<20%CV时所能检测到的最低极限浓度,它反映在实际样品检测时所能达到精确定量的检测极限。 十四、如何理解说明书中的稀释回收率? 稀释回收率与稀释线性不不完全是一回事,但是二者可用同一个研究方式来检验,要进行 稀释回收率测定首先用户需要选取…个已知浓度的病人样本,在分析项目的线性范围内对 其进行多点稀释后进行检测,如果所测得结果与最初的样本稀释系数结果相匹配,那么就 验证了稀释回收率与检测线性范围。稀释线性与回收率的区别在于,将一组分析物校准品 当未知样品进行分析,来对其检测线性范围进行验证。 十五、定标液为冻干粉的些注意事项? 如 T3、T4、FT3、FT4、TSH等 冻干粉定标液复溶:复溶水的水质加样容器的准确度加样的技术混匀/旋转 复溶后定标液保存:使用合适的冷冻保存试管正确标签无霜冰箱保存 十六、化学发光项目是否可以使用血浆等其他样本类型,有无影响? 并不是所有的免疫项目都可以使用血浆,具体请参阅项目说明书,但为了避免不同项目样本类型的差异,同时保证同一患者使用同样的样本类型,因此我们推荐统一使用血清样本。 十七、样本溶血、脂血对化学发光结果项目有影响吗? 样本溶血、脂血、黄疸对化学发光项目同样是有影响的,不过影响机制与影响比色等 项S不同。如溶血对胰岛素影响是因为样本溶血后红细胞释放种胰岛素灭活酶而使样 本中胰岛素浓度减少。不同项目对样本禁忌要求不同,具体请査阅“化学发光项目速査 样本禁忌内容”。 十八、样本分析前处理都应该注意什么? 有以下几点需特别注意: 一、采血管质量,有无失效,添加剂是否适当,釆血员专业水平 二、釆血量是否适当,是否及时进行混匀,血浆应该8-10次,血清应该5次。 三、血清凝固时间是否充足,离心是否彻底,离心机是否定期校正。 四、贮存条件是否适当。 十九、什么是分析灵敏度和功能灵敏度? 最低检测浓度/极限(Minimal detectable concentration/limit, MDC/MDL)是反映最低可 区别于 零值的浓度,又称分析灵敏度(Analytical sensitivity)。功能灵敏度(Functional sensitivity) 为<20%CV时所能检测到的最低极限浓度,它反映在实际样品检测时所能达到 精确定暈的检测极限。 二十、切点(Cut-off)的概念是什么? 最理想的切点是能将二个不同人群完全分开,例如疾病人群和正常人群。而实际状况是人群之间会有一个交叉,所以切点就只能在临床灵敏度和特异性之间寻找一个相对的平衡点,也就是说需符合临床的大多数的需求。 |